分光光度计是一类重要的分析仪器,无论在物理学、化学、生物学、医学、材料学、环境科学等研究领域,还是在化工、医药、环境检测、冶金等现代生产与管理部门,紫外可见分光光度计都有广泛而重要的应用。分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。由于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量样本量很小,于是超微量分光光度计应运而生。
目前超微量分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器,应用液体的表面张力特性,样品体积只需要0.5~2μL,在检测台上,经上下臂的接触拉出固定的光径,达到快速、微量、高浓度及不用石英管、毛细管等耗材检测吸光度的特点,被广泛应用于生命科学实验室蛋白质组学和基因组学等领域。
超微量分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成,与传统分光光度计有明显的不同。二者有以下7点区别:
(1)所需样品体积小,仅需0.5~2μL;
(2)不需要比色皿,用移液枪直接将样品滴加到检测平台上,测量时样品自动形成液柱,检测完成后只需用干净的吸水纸将样品从检测平台上擦拭干净即可;
(3)一般具有1mm和0.2mm两个光程(电机控制自动选择),而传统分光光度计的光程为10 mm,分光光度计样品无需稀释,测量范围可达到常规分光光度计的50倍;
(4)氙气闪光灯为灯源,代替了氘灯(紫外)和钨灯(可见),使用寿命更长;
(5)不需要预热,可随时检测;
(6)显示吸光度值的同时,程序直接给出浓度值(核酸、蛋白和荧光染料);
(7)体积比传统分光光度计小很多(用体积数值表述)。
目前市场上比较常见的超微量分光光度计有:美国Thermo Scientific的Nanodrop系列产品,德国伯赫的Colibri,英国Picodrop公司的P100、CUBE和P200系列产品,GE的Nano Vue和英国Biodrop公司产品,以及其它一些品牌。
超微量分光光度计与传统的紫外可见分光光度计工作原理相同,都是根据物质的分子对紫外、可见区辐射(光)的选择性吸收和朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律对物质进行定量分析和定性鉴别的仪器。
朗伯-比尔定律的数学表达式为:
式中:A—物质的吸光度;
I0—入射的单色光强度;
I—透射的单色光强度;
T—物质的透射比;
k—物质的吸光系数;
l—被分析物质的光程;
c—物质的浓度。
由此可见,单色光辐射穿过被测物质溶液时,被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度(光程)成正比。物质对光的选择性吸收波长,以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后,可用同样条件将该供试品配成溶液,测定其吸光度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。
现行的紫外可见分光光度计检定依据为JJG178-2007《紫外、可见、近红外分光光度计》国家计量检定规程。
其中规定透射比标准物质:质量分数为0.06000/1000重铬酸钾的0.001mol/L高氯酸标准溶液。
分别在235nm、257nm、313nm、350nm处测量透射比三次。重铬酸钾标准溶液在相应波长下不同温度的透射比值如表1所示。
表1 指定波长下不同温度下的标准物质透射比
(单位:%)
1 超微量分光光度计检测方法
如何实现对超微量分光光度计的检测,以下用实例说明:
1.1 透射比准确度和重复性的测量
用一台美林恒通公司的SMA4000型号的全波长连续扫描(200~900nm)超微量分光光度计。
图1
打开SMA4000控制软件,点击“UV-Vis”进入紫外可见分光光度计测量窗口(如图1)。分别在235nm、257nm、313nm、350nm处,将重铬酸钾标准溶液[紫外分光光度计溶液标准物质GBW(E)130066]作为样本进行测量。
以波长为313nm点为例,详细说明对超微量分光光度计透射比准确度的检测方法。用移液器取标准空白溶液2μL,并加载到被检仪器的测量平台上。点击界面下方的“Blank”键调零。接着点击“Measure”键读出仪器在313nm的调零结果,同时进行确认(如图2)。
将测量平台擦拭干净后,加入2μL重铬酸钾标准溶液,点击“Measure”键,进行测量。测量结果如图3所示,波长设置到313nm时,光径为1mm时,吸光度值为0.030;光径为0.2mm时,吸光度值为0.006。
首先,超微量紫外可见分光光度计结果为吸光度值,然而紫外分光光度计溶液标准物质(重铬酸钾标准溶液)证书的特性量值用透射比表示。其次,超微量紫外可见分光光度计光径为1mm或0.2mm,和紫外分光光度计溶液标准物质内径为10nm的标准石英吸收池定值条件并不一致。这样就需要对所测出的结果进行数据处理。
图2
图3
由朗伯-比尔定律A=klc可知,被测物质的光程和吸光度值成正比,可将超微量分光光度计波长为313nm时,光径为1mm的吸光度值0.030,扩大10倍,转化成光径为10mm的吸光度值为0.300。同理,光径为0.2mm的吸光度值0.006,扩大50倍,转化成光径为10mm的吸光度值也为0.300。又根据朗伯-比尔定律A=-lg T,可得T=10-A。超微量分光光度计波长为313nm时,T=10-0.300=50.1%。
依据JJG178-2007《紫外、可见、近红外分光光度计》国家计量检定规程要求,分别在235nm、257nm、313nm、350nm处测量透射比三次。测量结果如下表2
表2 重铬酸钾标准溶液透射比示值误差和重复性
依据JJG178-2007规程的计量性能要求,透射比最大允许误差≤±2.0%,透射比重复性≤1.0%,符合Ⅳ级仪器指标要求。
1.2 波长准确度的测量
进入超微量紫外可见分光光度计测量窗口,取2μL的去离子水加载到被检仪器的测量平台上用“Blank”键调零,并保存基线。再将测量平台擦拭干净后,加入2μL氧化钬溶液波长标准物质(BW13072),用“Measure”键进行测量。测量结果如图4所示。
图4
经过扫描图4中出现两条氧化钬的光谱曲线,其中上面的是光径为1mm的光谱曲线,下面的则为光径为0.2mm的光谱曲线。
通过方向键移动左右光标,可依次查找200nm~900nm的指定波长,配合图谱下方的数据列表,找出氧化钬光谱曲线的波峰值(与其对应的则是光谱曲线透射比的波谷值)。测量结果如下表3所示
表3 波长示值误差和重复性
依据JJG178-2007规程的计量性能要求,波长在200nm~340nm区段,最大允许误差≤±2nm,波长在340nm~900nm区段,最大允许误差≤±4nm,波长重复性≤1nm,符合Ⅳ级仪器指标要求。
1.3 杂散光的测量
进入超微量紫外可见分光光度计测量窗口,取2μL的去离子水加载到被检仪器的测量平台上,用“Blank”键调零。再将测量平台擦拭干净后,加入2μL的生化分析仪校准用溶液标准物质(BW2025)中的亚硝酸钠标准溶液(注:溶液浓度为50g/L),用“Measure”键进行测量。测量结果如图5所示。
又根据朗伯-比尔定律,先将仪器测量的吸光度值转化成光径为10mm的吸光度值:A10nm=10A1nm=1.412×10=14.12。超微量分光光度计波长为340nm时杂散光的结果,转化成T=10-A=10-14.12=0.0%。
依据JJG178-2007规程的计量性能要求,仪器杂散光(透射比)≤0.1%,符合Ⅰ级仪器指标要求。
图5
对于其他厂家的超微量分光光度计检测方法也类似,都是利用标准溶液法检测,主要区别在于波长范围和光程等指标。
2 常见超微量分光光度计检测中的问题及分析
2.1 超微量分光光度计的零点漂移
以一台美国Thermo Scientific公司的Nanodrop系列超微量分光光度计为例。用紫外分光光度计标准物质(重铬酸钾标准溶液)检测仪器透射比准确度,分别设置235nm、257nm、313nm、350nm四点波长,以空白溶液为参比,在对应波长下调零后,用紫外分光标准溶液测量被测仪器的透射比。
表4 测量结果和数据处理
测量结果与紫外可见分光光度计标准物质透射比差别较大,且连续测量3次,对测量结果的影响不大。
经过测量结果数据分析,仪器经转化后的透射比结果比标准值小,得出吸光度值原始测量结果则比吸光度的标准值大,其中发现吸光度的误差变化成线性,且误差均是0.10。
这样将标准空白溶液当成样本,测量空白溶液吸光度值,发现空白溶液的吸光度值为0.010(被测仪器的光径为1mm)。转化成光径为10mm的吸光度对应正好也就相差0.10。这种方法可以测量出该仪器的零点漂移。把仪器的吸光度的本底减去后符合朗伯-比尔定律。
2.2 超微量分光光度计的重复性变化规律
通过透射比与吸光度的关系图(图6),其中横坐标为吸光度(A),纵坐标为透射比(T),由此可以看出吸光度与透射比成负对数关系。
图6
由于超微量分光光度计吸光度显示精确到“0.001”。经过光径换算后1mm到10mm,吸光度的实际分辨力降为“0.01”。这时由吸光度计算出的透射比分辨力也随着成指数下降,同时也就影响测量该仪器的重复性。
例如,测量超微量分光光度计257nm处溶液标准物质[GBW(E)130066],仪器显示的吸光度值为0.086,此时对应的透射比13.8%。当仪器显示的吸光度最小分度值变化时,当吸光度为0.085,则透射比为14.1%;当吸光度为0.087,则透射比为13.5%。这样可以看出吸光度最小分度值变化,使仪器的重复性变为0.3%。
根据对数函数曲线(图6)的变化规律,可以看出吸光度值越小,透射比变化越大。当测量313nm处溶液标准物质时,仪器显示的吸光度值为0.029,此时对应的透射比51.3%。当仪器显示的吸光度最小分度值变化时,当吸光度为0.030,则透射比为50.1%;当吸光度为0.028,则透射比为52.5%。这样可以看出吸光度最小分度值变化,使仪器的重复性变为1.2%。
依据JJG178-2007的要求透射比重复性不得大于1.0%(Ⅳ级仪器)。如果313nm处吸光度最小分度值有变化,那么该仪器就超出规程所规定的误差范围。这是对超微量分光光度计检测过程中需要特别注意的。综上所述,超微量分光光度计检测用溶液标准物质的标准值建议为吸光度值。
3 结束语
通过上述的检测方法阐述和问题分析,对判断超微量分光光度计的计量性能有了更加可行的手段和方法。依据JJG178-2007《紫外、可见、近红外分光光度计》中的要求,并没有规定对超微量分光光度计有效的检测方法。因此结合计量部门的实际情况,设计一套有效的检测方法,使得计量标准得到有效的量值传递,也同时解决了超微量分光光度计此前无法量值溯源问题,是值得在今后的工作中加以推广并完善的。
发布时间：2025-11-23 
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