超微量分光光度计检测方法研究
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超微量分光光度计检测方法研究


    超微量分光光度计目前成为现代分子生物实验室常规仪器,广泛应用于生命科学实验室蛋白质组学和基因组学等领域。应用液体的表面张力特 性,检测时经上下臂的接触拉出固定的光径,达到快速、微量、高浓度检测吸光度的特点。本文阐述了如何用现有的国家标准物质对超微量分光光度计进 行检测,并举例说明对超微量分光光度计透射比、波长和杂散光等主要指标检测方法。最后对超微量分光光度计日常检测过程中可能遇到的问题并对其 进行分析。

 分光光度计是一类重要的分析仪器,无论在物理学、 化学、生物学、医学、材料学、环境科学等研究领域,还是 在化工、医药、环境检测、冶金等现代生产与管理部门, 紫外可见分光光度计都有广泛而重要的应用。分光光度 计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪 器。由于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量样本 量很小,于是超微量分光光度计应运而生。
目前超微量分光光度计已经成为现代分子生物实验 室常规仪器,应用液体的表面张力特性,样品体积只需要 0. 5 ~2 pL,在检测台上,经上下臂的接触拉出固定的光 径,达到快速、微量、高浓度及不用石英管、毛细管等耗材 检测吸光度的特点,被广泛应用于生命科学实验室蛋白 质组学和基因组学等领域。
超微量分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检 测器、信号处理器和显示与存储系统组成,与传统分光光 度计有明显的不同。二者有以下7点区别:
(1) 所需样品体积小,仅需0.   5 ~2^L<
(2)  不需要比色皿,用移液枪直接将样品滴加到检 测平台上,测量时样品自动形成液柱,检测完成后只需用 干净的吸水纸将样品从检测平台上擦拭干净即可;
(3 ) —般具有1mm和0.2mm两个光程(电机控制自动 选择),而传统分光光度计的光程为10 mm,分光光度计样品 无需稀释,测量范围可达到常规分光光度计的50倍;
(4)  氙气闪光灯为灯源,代替了氘灯(紫外)和钨灯 (可见),使用寿命更长;
(5)  不需要预热,可随时检测;
(6)  显示吸光度值的同时,程序直接给出浓度值(核 酸、蛋白和荧光染料);
(7)体积比传统分光光度计小很多(用体积数值表述)。
目前市场上比较常见的超微量分光光度计有:美国ThermoScientific的Nanodrop系列产品,德国伯赫的Co- libri,英国Picodrop公司的P100、CUBE和P200系列产 品,GE的NanoVue和英国Biodrop公司产品,以及其它 —些品牌。
超微量分光光度计与传统的紫外可见分光光度计工 作原理相同,都是根据物质的分子对紫外、可见区辐射 (光)的选择性吸收和朗伯-比尔(Lambert - Beer)定律 对物质进行定量分析和定性鉴别的仪器。
朗伯-比尔定律的数学表达式为:
A = - Ig (I/I0) = - lgT = klc 式中:A一物质的吸光度;
I0 一入射的单色光强度;
I一透射的单色光强度;
T一物质的透射比;
A—物质的吸光系数;
I 一被分析物质的光程; c 一物质的浓度。
由此可见,单色光辐射穿过被测物质溶液时,被该物 质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度(光程)成正 比。物质对光的选择性吸收波长,以及相应的吸收系数 是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的 吸收系数后,可用同样条件将该供试品配成溶液,测定其 吸光度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。

现行的紫外可见分光光度计检定依据为JJG178 - 2007 〈紫外、可见、近红外分光光度计》国家计量检定规程。
其中规定透射比标准物质:质量分数为0. 06000/ 1000重铬酸钾的0. 001mol/L高氯酸标准溶液。
分别在235nm、257nm、313nm、350nm处测量透射比 三次。重铬酸钾标准溶液在相应波长下不同温度的透射 比值如表1所示。
表1指定波长下不同温度下的标准物质透射比(单位:%)

波长
温 度
235nm 257nm 313nm 350nm
10^ 18. 0 13. 5 51. 2 22. 6
15^ 18. 0 13. 6 51. 3 22. 7
20^ 18. 1 13. 7 51. 3 22. 8
25^ 18. 2 13. 7 51. 3 22. 9
30^ 18. 3 13. 8 51.4 22. 9
 
1超微量分光光度计检测方法
如何实现寸超微量分光光度计的检测,以下用实例说明:
1. 1透射比准确度和重复性的测量
用一台美林恒通公司的SMA4000型号的全波长连 续扫描(200~900nm)超微量分光光度计。
 

 
 

 
图1
打开SMA4000控制软件,点击“UV - Vis”进入紫外 可见分光光度计测量窗口(如图1)。分别在235nm、 257nm、313nm、350nm处,将重铬酸钾标准溶液紫外分光光 度计溶液标准物质GBW (E) 130066]作为样本进行测量。
以波长为313nm点为例,详细说明对超微量分光光 度计透射比准确度的检测方法。用移液器取标准空白溶 液2|xL,并加载到被检仪器的测量平台上。点击界面下 方的“Blank”键调零。接着点击 “Measure ”键读出仪器在 313nm的调零结果,同时进行确认(如图2)。
将测量平台擦拭干净后,加入2|xL重铬酸钾标准溶 液,点击“Measure”键,进行测量。测量结果如图3所示, 波长设置到313nm时,光径为1mm时,吸光度值为
0. 030;光径为0. 2mm时,吸光度值为0. 006。
首先,超微量紫外可见分光光度计结果为吸光度值, 然而紫外分光光度计溶液标准物质(重铬酸钾标准溶 液)证书的特性量值用透射比表示。其次,超微量紫外可 见分光光度计光径为1mm或0. 2mm,和紫外分光光度计溶

 
由朗伯-比尔定律A = klc可知,被测物质的光程和 吸光度值成正比,可将超微量分光光度计波长为313nm 时,光径为1mm的吸光度值0. 030,扩大10倍,转化成光 径为10mm的吸光度值为0. 300。同理,光径为0. 2mm 的吸光度值0. 006,扩大50倍,转化成光径为10mm的吸 光度值也为0. 300。又根据朗伯-比尔定律A = - lgT, 可得T =10 _A。超微量分光光度计波长为313nm时,:T =
10-OJ0 =50. 1 %。
依据JJG178 - 2007《紫外、可见、近红外分光光度 计》国家计量检定规程要求,分别在235nm、257nm、 313nm、350nm处测量透射比三次。测量结果如下表2

表2重铬酸钾标准溶液透射比示值误差和重复性
波长 Ts[ %)   T(( %)   T(( %) AT[ %) 8t( %)
(nm) 1 2 3
235 18. 1 16.2 16. 2 16. 6 16. 3 -1.8 0.4
257 13.7 13. 2 13. 2 13. 5 13. 3 -0.4 0.3
313 51.3 50. 1 50. 1 50. 1 50. 1 -1. 2 0. 0
350 22. 8 22.4 22. 4 22.9 22. 6 -0. 2 0. 5
 
 
 
依据JJG178 -2007规程的计量性能要求,透射比最 大允许误差在±2. 0% ,透射比重复性在1. 0% ,符合W级 仪器指标要求。
1.2波长准确度的测量


经过扫描图4中出现两条氧化钬的光谱曲线,其中 上面的是光径为1mm的光谱曲线,下面的则为光径为
0. 2mm的光谱曲线。
通过方向键移动左右光标,可依次查找200nm ~ 900nm的指定波长,配合图谱下方的数据列表,找出氧化 钬光谱曲线的波峰值(与其对应的则是光谱曲线透射比 的波谷值)。测量结果如下表3所示
表3波长示值误差和重复性

241 239 239 239 239 -2 0
361 362 362 362 362 1 0
416 418 418 418 418 2 0
451 452 452 452 452 1 0
537 541 541 541 541 4 0
640 644 644 644 644 4 0
As( nm)
 

A£( nm)
1     2      3
 

A; (nm) AA (nm)
 

Sa( nm)
 

 
依据JJG178 -2007规程的计量性能要求,波长在 200nm ~ 340nm区段,最大允许误差在± 2nm,波长在 340nm ~900nm区段,最大允许误差在±4nm,波长重复 性在1。@,符合W级仪器指标要求。
1. 3杂散光的测量
进入超微量紫外可见分光光度计测量窗口,取2|xL 的去离子水加载到被检仪器的测量平台上,用“Blank”键 调零。再将测量平台擦拭干净后,加入2|xL的生化分析 仪校准用溶液标准物质(BW2025)中的亚硝酸钠标准溶 液(注:溶液浓度为50g/L),用“Measure”键进行测量。 测量结果如图5所示。
又根据朗伯-比尔定律,先将仪器测量的吸光度值 转化成光径为10mm的吸光度值:A10nm = IOA1nm = 1. 412 XlO = 14. 12。超微量分光光度计波长为340nm时杂散光的结果,转化成T =10 _

 
对于其他厂家的超微量分光光度计检测方法也类 似,都是利用标准溶液法检测,主要区别在于波长范围和 光程等指标。
2常见超微量分光光度计检测中的问题及分析
2.  1超微量分光光度计的零点漂移
以一台美国ThermoScientific公司的Nanodrop系列 超微量分光光度计为例。用紫外分光光度计标准物质 (重铬酸钾标准溶液)检测仪器透射比准确度,分别设置 235nm、257nm、313nm、350nm四点波长,以空白溶液为参 比,在对应波长下调零后,用紫外分光标准溶液测量被测 仪器的透射比。
表4测量结果和数据处理

  235nm 257nm 313nm 350nm
显示吸光度(光径1mm) 0. 084 0. 096 0. 039 0. 074
转换后吸光度(光径10mm) 0. 84 0. 96 0. 39 0. 74
转换后透射比(光径10mm) 14. 5% 11. 0% 40. 7% 18. 2%
标准物质透射比(光径10mm) 18. 1% 13. 7% 51. 3% 22. 8%
标准物质吸光度(光径10mm) 0. 74 0. 86 0. 29 0. 64
透射比误差(光径10mm) -3. 6% -2. 7% -10. 6% -4. 6%
吸光度误差(光径10mm) 0. 10 0. 10 0. 10 0. 10
 
 
测量结果与紫外可见分光光度计标准物质透射比差 别较大,且连续测量3次,对测量结果的影响不大。
经过测量结果数据分析,仪器经转化后的透射比结 果比标准值小,得出吸光度值原始测量结果则比吸光度 的标准值大,其中发现吸光度的误差变化成线性,且误差 均是0. 10。
这样将标准空白溶液当成样本,测量空白溶液吸光 度值,发现空白溶液的吸光度值为0. 010 (被测仪器的光 径为1mm)。转化成光径为10mm的吸光度对应正好也 就相差0. 10。这种方法可以测量出该仪器的零点漂移。 把仪器的吸光度的本底减去后符合朗伯-比尔定律。
2.2超微量分光光度计的重复性变化规律
通过透射比与吸光度的关系图(图6),其中横坐标 为吸光度(A),纵坐标为透射比(由此可以看出吸光


由于超微量分光光度计吸光度显示精确到“0.001”。 经过光径换算后1mm到10mm,吸光度的实际分辨力降为 ‘0. 01”。这时由吸光度计算出的透射比分辨力也随着成指 数下降,同时也就影响测量该仪器的重复性。
例如,测量超微量分光光度计257nm处溶液标准物 质Gbw(E) 130066],仪器显示的吸光度值为0.086,此 时对应的透射比13.8%。当仪器显示的吸光度最小分 度值变化时,当吸光度为0. 085,则透射比为14. 1% ;当 吸光度为0.087,则透射比为13.5%。这样可以看出吸 光度最小分度值变化,使仪器的重复性变为0. 3%。
根据对数函数曲线(图6)的变化规律,可以看出吸 光度值越小,透射比变化越大。当测量313nm处溶液标 准物质时,仪器显示的吸光度值为0. 029,此时对应的透 射比51. 3%。当仪器显示的吸光度最小分度值变化时, 当吸光度为0.030,则透射比为50.1% ;当吸光度为

 
 
0.028,则透射比为52.5%。这样可以看出吸光度最小 分度值变化,使仪器的重复性变为1. 2%。
依据JJG178 -2007的要求透射比重复性不得大于0. 0% ( W级仪器)。如果313nm处吸光度最小分度值有 变化,那么该仪器就超出规程所规定的误差范围。这是 对超微量分光光度计检测过程中需要特别注意的。综上 所述,超微量分光光度计检测用溶液标准物质的标准值 建议为吸光度值。
3结束语
通过上述的检测方法阐述和问题分析,对判断超微 量分光光度计的计量性能有了更加可行的手段和方法。 依据JJG178 - 2007《紫外、可见、近红外分光光度计》中 的要求,并没有规定对超微量分光光度计有效的检测方 法。因此结合计量部门的实际情况,设计一套有效的检 测方法,使得计量标准得到有效的量值传递,也同时解决 了超微量分光光度计此前无法量值溯源问题,是值得在 今后的工作中加以推广并完善的。
参考文献
[1] JJF178 -2007《紫外、可见、近红外分光光度计检定规程》[S].北 京:中国计量出版社,2008.
2]     李昌厚.紫外可见分光光度计[M].北京:化学工业出版社,
2005.
3]     叶君安,尹德金.紫外、可见、近红外分光光度计检定规程部分技 术指标说明CO .工业计量,2010(4).
4]                    李潞铭.JJF178     -2007《紫外、可见、近红外分光光度计检定规程 解读》U .中国计量,2008(7).