紫外可见光分光光度法在食品工业中的应用
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紫外可见光分光光度法在食品工业中的应用

 
        摘要:紫外--可见分光光度法是根据物质分子对波长为200-760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。操作简单、准确度高、重现性好。
      其应用范围包括:①定量分析,广泛用于各种物料中微量、超微量和常量的无机和有机物质的测定。②定性和结构分析,紫外吸收 光谱还可用于推断空间阻碍效应、氢键的强度、互变异构、几何异构现象等。③反应动力学研究,即研究反应物浓度随时间而变化的函数关系,测定反应速度和反应级数,探讨反应机理。④研究溶液平衡,如测定络合物的组成,稳定常数、酸碱离解常数等。
     紫外-可见光分光光度法在食品行业中的应用主要可大致分为在食品成分分析中的应用和在食品安全检测中的应用,其中在食品成分分析中的应用主要有紫外-可见分光光度计在食品酶分析中的应用、酸奶中维生素A的测定、水果汁中果糖的测定、番茄红素的测定、甜蜜素的测定等;而在食品安全检测中的应用主要有分光光度法测定食品中硼砂、紫外可见分光光度法检测食品中的镉、紫外可见分光光度法测定食品中的苏丹红Ⅲ、用分光光度法测定食品中吊白块的含量等。
     本文分别就紫外-可见光分光光度法在食品工业中的这些应用作了简要介绍。目前利用紫外-可见光分光光度法的各种方法正在逐步发展,而且随着社会的发展和人们生活水平的提高,紫外-可见光分光光度法在食品行业中的应用也会越来越广泛。
      一:紫外--可见分光光度法简介
        紫外--可见分光光度法:是根据物质分子对波长为200-760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法。操作简单、准确度高、重现性好。波长长(频率小)的光线能量小,波长短(频率大)的光线能量大。分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。
描述物质分子对辐射吸收的程度随波长而变的函数关系曲线,称为吸收光谱或吸收曲线。紫外-可见吸收光谱通常由一个或几个宽吸收谱带组成。最大吸收波长(λmax)表示物质对辐射的特征吸收或选择吸收,它与分子中外层电子或价电子的结构(或成键、非键和反键电子)有关。朗伯-比尔定律是分光光度法和比色法的基础。这个定律表示:当一束具有I0强度的单色辐射照射到吸收层厚度为b,浓度为c的吸光物质时,辐射能的吸收依赖于该物质的浓度与吸收层的厚度。其数学表达式为: 式中的A叫做吸光度;I0为入射辐射强度;I为透过吸收层的辐射强度;(I/I0)称紫藤为透射率T;ε是一个常数,叫做摩尔吸光系数,ε值愈大,分光光度法测定的灵敏度愈高。
仪器类型则有:单波长单光束直读式分光光度计,单波长双光束自动记录式分光光度计和双波长双光束分光光度计。
 
二:在食品成分分析中的主要应用
⑴紫外-可见分光光度计在食品酶分析中的应用:
1.酶对食品加工的影响
        酶是生物活细胞产生的一类具有催化功能的蛋白质。酶除了具有高的催化效率特性外,还具有很高的专一性,利用它能选择性地将个别食品组分改性,而不影响到其它组分。因此,酶在食品科学中相当重要,通过酶的作用能引起食品原料的品质发生变化,也能在比较温和的条件下加工和改良食品。
2.紫外-可见分光光度法测定酶活
1'. β一半乳糖苷酶
         β一半乳糖苷酶,又称乳糖酶(Lactase)。能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量,从而提高乳制品的可消化性,用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变,同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物,37℃保温酶解,每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量,定义为1个酶活力单位。
2'. 超氧化物歧化酶
          超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类,是生物体内超氧阴离子清除剂,保护细胞免受损伤。SOD广泛存在于各类生物体内,所有好氧微生物细胞中都含有SOD。自1969年Mccord等人首次发现了SOD生物活性后,医学界对其医疗作用做了许多研究,证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用,被专家称为21世纪最有前途的药用酶。欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃ 4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液,再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚,迅速摇匀,倒人光径lcm 的比色杯,在325nm波长下每隔30s测一次A值。同时测定Sigma公司的SOD标准品,对所测样品SOD活性进行校正。
【酶活定义】在lml反应液中,每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个酶活单位, 即325nm 0.035OD/min为一个酶活单位。
3'. 多酚氧化酶
       多酚氧化酶(PPO)是一类由核基因编码在细胞质中合成的含铜质体的金属酶,其作用机理在于铜的氧化-还原作用。大麦中的多酚物质经过PPO的催化氧化后,具有单宁性质,易和蛋白质起交联作用而沉淀出来,进而影响啤酒的色泽、泡沫、风味和非生物稳定性。大麦中部分PPO以"潜伏"状态存在,在浸麦过程中,可通过去除一些酶抑制剂、蛋白酶作用或其他的一些方式使其活性在浸麦过程中提高。在大麦发芽过程中,PPO的活力较高,影响着麦芽的质量。因此,在制麦过程中应该降低PPO活性。
酶活测定】0.1mL酶液与lmL 0.1 mol/L邻苯二酚(用pH 8.4柠檬酸-磷酸缓冲液配制)80oC反应3min,用2mL 20%TCA终止反应,于波长450nm处用分光光度计测定吸收值。
【酶活定义】上述条件下,将每分钟OD值增加0.01定义为1个酶活力单位。
⑵紫外-可见分光光度法分析食品中的多种物质: 
酸奶中维生素A的测定
         酸奶是一种发酵奶制品,由于其丰富的营养成分以及独特的风味、口感而深受人们的喜爱。酸奶中含有一定量的维生素A,作为人体必需的营养元素,分析测定维生素A的含量具有重要的意义。目前分析维生素A的方法很多,有荧光分光光度法、气相色谱洁、高压液相色谱法、可见分光光度法。其中比较常用的是采用三氯化锑作为显色剂的分光光度法,但这种方法有几个缺点。首先,生成的蓝色化合物不稳定,很快褪色,比色测定必须在6s内完成:其次,三氯化锑具有强腐蚀性及毒性;此外,很易吸水,受温度、湿度的影响大,器皿装过试剂后难于洗涤等。王明华等采用紫外分光光度法分析测定酸奶中维生素A的含量,样品经过皂化、提取、除溶剂等步骤后,于328 nm处测定其吸光度,测得维生素A的回收率为103. 3%,平均值的标准偏差为0. 32,变异系数为0.01;同时进行了维生素D对维生素A测定的干扰实验,实验结果表明,维生素D的存在不影响维生素A的测定结果。该方法与三氯化锑比色法相比,操作简便、安全。【1】
②水果汁中果糖的测定
          果糖的测定法有高效液相色谱法、离子选择电极法、傅里叶变换近红外光谱法和分光光度法等,前三种方法的操作都较复杂,而分光度法报道的方法中均加入显色剂,如间苯二酚,铁氰化钾等,这些物质对环境有污染。占达东"1通过1 14研究发现:果糖在盐酸的作用下可生成羟甲基糠醛,通过对果糖在盐酸介质中的吸收光谱进行扫描,发现在波长291 nm处有最大吸收:果糖浓度在0~30 u g/mL范围内服从比尔走律。利用该研究用紫外分光光度法测定了苹果鲜汁、鸭梨鲜汁和桶子鲜汁中的果糖含量。通过研究发现该方法具有很好的选择性和较高的灵敏度,适用于组成较复杂的分析对象中的果糖含量测定。该方法具有简便、快速、灵敏,对环境不造成污染,样品无需预处理等特点。【3】
③番茄红素的测定
          番茄红素是一种具有多种生理功能的类胡萝I、素,通常状况下与其它类胡萝I、素同时存在于多种生物体中。在实际研究中,番茄红素的准确测定始终是困扰研究人员的一个难题。目前的测定方法主要有:(1)以苏丹红代替番茄红素作为标准品,绘制标准曲线,用以测定番茄红素的含量;  (2)以石油醚或正己烷为溶剂,在472 nm比色测定其吸收光度,用摩尔消光系数(E1 00巾1  cm= 3450)来计算其中番茄红素的含量;  (3)依高压液相色谱法,通过与标准样品的峰面积比来测定样品中番茄红素的含量。现有这几种测定番茄红素的方法普遍存在着一定的缺陷,(1)和(2)不需要标准品,但其系统误差较太,同时又不能排除B一胡萝l、素等其它类胡萝I、素的干扰;(3)要求番茄红素的标准样品,而高纯度的番茄红素本身稳定性很差,不宜长期存放,且价格非常昂贵,日常测定难度很大。而HPLC测定又要受到仪器设备及标准样品的限制。张连富心1等从番茄红素及B一胡萝l、素(影响番茄红素测定的含量最多的类胡萝l\素)的紫外吸收光谱的差异入手,确定了以含2%二氯甲烷为溶剂、以502 nm吸收峰为检测波长的番茄红素测定方法,避免了其它类胡萝I、素的干扰,并将其转化为用消光系数来计算的形式,避免了番茄红素标准样品的制约。溶液中番茄红素的浓度在0. 0017~3. 12 u g/mL范围内时,该检测方法的可信度在90%以上。【2】
④食品中甜蜜素的测定
         用乙酸乙酯在酸性条件下提取食品中的甜蜜素,再以碱性水反提取,加入过量的次氯酸钠将甜蜜素转变为N,N-二氯环己胺,溶于环己烷\[4],在波长304nm处测定。
         仪器和试剂: 754紫外分光光度计为上海第二光学仪器厂产品;乙酸乙酯、环己烷、10%(φ)硫酸、0.1mol/L氢氧化钠、20g/L次氯酸钠溶液(均为分析纯试剂);1.0g/L甜蜜素标准液,由国家标准物质研究中心提供,1999年1月定值。
标准曲线制作:分别吸取甜蜜素标准液0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL(相当于甜蜜素0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mg)于250mL分液漏斗中。各加入10%硫酸100mL,乙酸乙酯80mL振摇提取2min,弃水相。用30、20、20mL0.1mol/L氢氧化钠溶液振摇提取3次,每次1min,合并水相于另一250mL分液漏斗中。往水相加入环己烷10mL振摇提取1min,弃去环己烷,加入10%硫酸15mL、环己烷10.0mL、20g/L次氯酸钠溶液5mL,振摇2min,再加入20g/L次氯酸钠溶液5mL,振摇2min,弃水相。先后用0.1mol/L氢氧化钠、蒸馏水各50mL洗涤环己烷层,经脱脂棉将环己烷滤于10mL比色管中,用环己烷调零,于波长304nm处测定吸光度。
样品测定:
1.液体食品称取相当含甜蜜素6.0mg样品(如含二氧化碳,先加热除去)于250mL分液漏斗中,以下同标准曲线方法测定。
2.可溶于水的固体称取相当含甜蜜素6.0mg样品加入适量的水溶解后,转入250mL分液漏斗中,以下同标准曲线方法测定。
3.不溶于水的固体称取适量经磨碎的固体于100mL容量瓶中,加水至刻度,不时摇匀,浸泡1h以上,取相当于甜蜜素6.0mg的滤液于250mL分液漏斗中,以下同标准曲线方法测定。【4】
三:在食品安全检测中的主要应用
         ⑴分光光度法测定食品中硼砂
碉砂、硼酸曾作为食品的防腐剂和膨松剂添加到肉丸等食品中,增加食物的韧性、脆度,有增强食物口感及外观的作用。硼砂、硼酸在体内蓄积,排泄很慢,影响消化酶的作用,每日食用0.5 9引起食欲减退,妨碍营养物质吸收,成人食用1-3 9即可引起中毒'¨,对人体有害,因此在我国硼砂、硼酸是禁用的食品添加剂。但从日常的检测结果看,还是有食品在加工过程使用硼砂、硼酸。硼砂、硼酸的标淮检验方法是④/T5009. 29 - 2003[2]的硼砂、硼酸定性试验,分别有姜黄试纸法和焰色反应。为开发新方法[3.4],现尝试用湿式消解法消化样品,电感耦合等离子体发射光谱法(ICP - AES法)测定食品中硼元素含量,以硼砂(Na28407  IOH,0计)估算硼砂、硼酸的加入量。对68份样品(包括牛肉丸、虾饺、粽、牛百叶、猪肚、猪大肠)用国标法定性测定和JCP - AES法定量测定,进行比对试验。
⑵紫外可见分光光度法检测食品中的镉
         分光光光度法是利用显色剂与镉离子形成稳定的显色络合物后可用分光光度计测定。此法具有简便、仪器简单等优点。胡劲梅等为了同时测定铅和镉,建立了以电荷耦合器件作为阵列光信号探测器,小型多色仪和专用微机组成的分光光度装置,研究了卟啉与铅极谱法。和镉显色反应的最佳条件。测定了合成试样、陶瓷等浸泡液中铅和镉的含量。李秋萍等通过对新试剂2,6-二甲苯基重氮氨基偶氮苯与镉显色反应研究,建立了检测食品中镉的新方法。叶瑞洪等通过分析比较FAAS、KI-MIBK螯合萃取FAAS和镉-碘化钾-罗丹明B分光光度法三种方法,从灵敏度、检出限、仪器价格等方面进行比较,得出采用镉一碘化钾.罗丹明B分光光度法测定食品中镉的含量方法最为简单易行,操作快速,灵敏度高、选择性好。
樊月琴等研究了4-甲基-2,5.二磺酸基苯基重氮氨基偶氮苯与镉的显色反应可用于镉的含量检测。沈燕等合成的1-(5-硝基-2-吡啶)-3-(偶氮苯磺酸)-三氮稀用于镉的检测结果较好。吴继魁等研究了meso-四(对羟基苯)卟琳光度法测定痕量镉的方法。王亮等研究了【2-4-甲基喹啉】-偶氮丁-5-二乙氨基苯酚与镉的显色反应,结果令人满意。李英杰等建立了以双硫腙为显色剂可同时测定锌、镉、铅的方法。庄海燕等探讨了在聚乙烯醇存在下,镉(Ⅱ)-碘化钾-罗丹明B分光光度法测定食品中微量镉的可行性。【5】
⑶紫外可见分光光度法测定食品中的苏丹红Ⅲ
           苏丹红Ⅲ号是一种人工合成的化工染料,化学名称为1-[4-(苯基偶氮)]偶氮-2-萘酚。苏丹红Ⅲ号为致癌物质[1,2],被禁止作为食品添加剂使用。我国和欧盟标准检测方法为液相色谱法[3,4],许多分析化学工作者对苏丹红染料的测定开展了研究,建立了一些有价值的测定方法,如HPLC法[5-7]、分子印迹固相萃取法[8]、毛细管液相色谱-质谱法[9]、电离质朴同位素稀释法[10]已应用于苏丹红染料的测定。但是上述方法由于仪器和试剂昂贵而难以普及。笔者研究了样品的处理方法,样品提取液用薄层展开后,用分光光度法测定,所用设备简单,分析结果与国家标准HPLC法准确度相当。
⑷用分光光度法测定食品中吊白块的含量
吊白块在使用过程中会分解出甲醛和二氧化硫,用分光光度法测量其在食品中的残留量,判断是否含有吊白块。本方法简单、快速、灵敏度高。
         甲醛合次硫酸氢钠(NaHSO2.CH2O.2H2O).俗称吊白块,易溶于水.遇酸、碱、高温即分解为甲醛和二氧化硫,作为增白剂、还原剂应用于纺织印染工业.由于甲醛已被国际上列为致癌物,所以吊白块严禁在食品工业中使用.但是近年来住市场发现个别小法商贩,唯利是图,在一些食品中使用吊白块增加漂白效果.严重的损害了消费者的健康。为了维护消费者的利益,保障广大人民群众的身体健康,建立食品中吊白块的测定方法已迫在眉睫.
        吊白块在使用过程中易分解,通过测定其分解产物甲醛、二氧化硫在食品的残量判定是否含有吊白块.日前,我国已有的甲醛测  定方法主要是针对包装材料、化工原料、化妆品、大气等.而食品中甲醛含量的测定方法还没有国家标准,甲醛的测定方法有分光光度法、,气象色谱法、液相色谱法、离子色谱法、示波极谱法等.本实验用分光先度法测定了米粉、粉丝、腐竹中甲醛含量,同时用GB/T5009. 34《食品中亚硫酸盐的测定方法》测定了相应样品中的二氧化硫的含量。
四:紫外 -可见分光光度法在食品行业中的发展趋势和展望
            在紫外区进行食品中某些指标的分光光度法测定,因其简便、快捷、有效而在食品分析中占有很大比重。在今后几年内,这种局面仍将维持下去。在可见区,因其灵敏度高、选择性好、方法灵活、适用面宽而受到越来越多的青睐。随着分析试剂的发展,尤其是具有识别能力的特效显色荆以及金属离子显色剂等的发展,使得可见区的分光光度食品分析法将可能出现一个迅速发展阶段。另外,随着化学计量学的发展,将化学计量学方法应用于食品光度分析,将是解决多组分测定以及复杂样品快速测定的有效途径。将色谱等分离分析技术与光度法联用,也是在复杂基体样品分析中常用的有效手段。
 随着社会的发展和人们生活水平的提高,食品分析现场化、家庭化的呼声越来越高。相应地对食品分析仪器的小型化、智能化的要求也越来越迫切。这些仪器的研制和生产,将会给食品光度分析注入新的活力。